Ένα άλλο πρόβλημα των πρώτων βιοτεχνολόγων αντιμετώπισε την αδυναμία να διακρίνει το θραύσμα του DNA κατέχουν το γονίδιο ενδιαφέροντος από τα πολυάριθμα χρωμοσωμικά θραύσματα που παράγονται από την πέψη με περιοριστικά ένζυμα του γονιδιώματος ενός οργανισμού.
Σε 1975 Edwin Southern έλυσε αυτό το πρόβλημα με το δικό του Τεχνική στυπώματος Southern.
Αυτή η διαδικασία επιτρέπει την ανίχνευση συγκεκριμένων θραυσμάτων DNA από ένα μείγμα μορίων DNA.
Το Southern blotting είναι μια διαδικασία τριών σταδίων: Διαχωρίστε τα μόρια DNA με ηλεκτροφόρηση, μεταφέρετε διαχωρισμένα μόρια DNA σε μια μεμβράνη και υβριδοποιήστε σε έναν επισημασμένο ανιχνευτή ειδικό για το γονίδιο ενδιαφέροντος.
Αφού διαχωριστούν τα θραύσματα DNA με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, αποδίδονται μονόκλωνα (δηλαδή μετουσιωμένα). Τα μετουσιωμένα μόρια DNA στη συνέχεια μεταφέρονται και συνδέονται σε μια νάιλον μεμβράνη.
ο DNA ενδιαφέροντος αναγνωρίζεται λούζοντας το φίλτρο σε διάλυμα που περιέχει α ραδιενεργός ανιχνευτήςτο οποίο είναι ένα θραύσμα επισημασμένου, μονόκλωνου νουκλεϊκού οξέος συμπληρωματικού προς το DNA που μας ενδιαφέρει.
Το DNA στο οποίο συνδέεται ο δεσμός υδρογόνου του ανιχνευτή είναι τώρα ραδιενεργό και ανιχνεύεται εύκολα από αυτοραδιογραφία.
Σε αυτοραδιογραφία, ένα φύλλο φωτογραφικού φιλμ τοποθετείται πάνω από τη μεμβράνη. Όταν αναπτύσσεται το φιλμ, εμφανίζονται ζώνες όπου δεσμεύεται ο ραδιενεργός ανιχνευτής, επειδή η ενέργεια που απελευθερώνεται από το ισότοπο προκαλεί το σχηματισμό κόκκων σκούρου αργύρου. Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν μη ραδιενεργοί ανιχνευτές για την ανίχνευση συγκεκριμένων DNA.
Μια κοινή ετικέτα είναι το μικρό μόριο βιοτίνης, μη ραδιενεργές ετικέτες συχνά ανιχνεύονται πιο γρήγορα και είναι ασφαλέστερα στη χρήση από τα ραδιοϊσότοπα.
Μέχρι τα τέλη της δεκαετίας του 1970, οι τεχνικές για την κλωνοποίηση του DNA χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ινσουλίνης και μέχρι το 1982 η εμπορική παραγωγή ινσουλίνης από γενετικά τροποποιημένη Ε. coli άρχισε.
Αυτό ήταν ένα σημαντική εξέλιξη για διάφορους λόγους: πρώτον, τα διαβητικά άτομα δεν έπρεπε πλέον να εξαρτώνται από την ινσουλίνη από χοίρους ή άλλα ζώα. Δεύτερον, απέδειξε την εμπορική σκοπιμότητα της χρήσης ανασυνδυασμένου DNA για τη δημιουργία ενός καλύτερου προϊόντος.
Αναφορά και Πηγές
- 1% – https://quizlet.com/218117184/success-in-cls-ch-10-molecular-diagnostics-flash-cards/
2% – https://en.m.wikipedia.org/wiki/Western_blot
1% – https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1350946218300715
