Εισαγωγή
Επεξεργασία γονιδιώματος Cas9 έχει γίνει γρήγορα ένα από τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα εργαλεία για την αλλαγή γονιδιωμάτων in vivo. Επεξεργασία γονιδιώματος Cas9 αναφέρεται συχνά ως CRISPR ή CRISPR-Cas9, αναφερόμενος στο στοιχείο του βακτηριακού γονιδιώματος από το οποίο αναπτύχθηκε, αλλά στην πραγματικότητα, μόνο το συστατικό Cas9 χρησιμοποιείται στην επεξεργασία. Οι νουκλεάσες Cas9 κωδικοποιούνται στο γονιδίωμα των περισσότερων βακτηρίων και των αρχαίων, όπου συνήθως γειτνιάζουν με έναν τόπο CRISPR, που συγκεντρώνονται τακτικά διακεκομμένες σύντομες παλινδρομικές επαναλήψεις.
Καθώς ανακαλύφθηκαν οι μηχανιστικές λεπτομέρειες της λειτουργίας Cas9, δύο ερευνητικές ομάδες, με επικεφαλής τη μία Τζένιφερ Ντούντνα και Emmanuelle Charpentier και το άλλο από Φενγκ Ζανγκ, προσπάθησε να προσαρμόσει το Cas9 για επεξεργασία γονιδιώματος. Σε αυτή τη διαδικασία, το γονιδιωματικό DNA μπορεί να τροποποιηθεί άμεσα και οι διαδικασίες είναι αρκετά γενικές ώστε να χρησιμοποιηθούν για οποιοδήποτε κύτταρο στο οποίο DNA μπορεί να εισαχθεί και να εκφραστεί.
Χαρακτηριστικά αναγνώρισης DNA της νουκλεάσης Cas9
Όπως τα ένζυμα περιορισμού, το Cas9 είναι μια ενδονουκλεάση που κόβει και τους δύο κλώνους ενός DNA στόχου. Ωστόσο, υπάρχει μια σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο τύπων νουκλεασών, όσον αφορά τον τρόπο με τον οποίο αναγνωρίζουν την αλληλουχία στόχο τους στο δίκλωνο DNA. Τα περιοριστικά ένζυμα αναγνωρίζουν τέσσερα έως οκτώ ζεύγη βάσεων μέσω των επαφών μεταξύ του μορίου DNA και αμινοξέων πλευρικές αλυσίδες στο ένζυμο. Το Cas9, ωστόσο, είναι μια ριβονουκλεο πρωτεΐνη που αποτελείται από ένα πολυπεπτίδιο και ένα οδηγό RNA (gRNA). Η αναγνώριση του DNA στόχου για διάσπαση λαμβάνει χώρα με υβριδισμό περίπου 20 βάσεων μεταξύ του gRNA και της συμπληρωματικής αλληλουχίας DNA του στο γονιδίωμα.
Στα μικρόβια, ο τόπος CRISPR είναι η πηγή του gRNA και η νουκλεάση Cas9 προστατεύει το κύτταρο από ιική επίθεση. Οι αλληλουχίες στον τόπο CRISPR προέρχονται κυρίως από κινητά γενετικά στοιχεία (βακτηριοφάγος και πλασμίδια), έτσι η νουκλεάση Cas9 σε ένα μικροβιακό κύτταρο στοχεύει ειδικά το DNA εισβολής για καταστροφή.
Η ακραία εξειδίκευση που παρέχεται από το gRNA είναι το κλειδί για την επεξεργασία του γονιδιώματος, επειδή κάθε αλληλουχία στόχου 20 βάσεων είναι σχεδόν σίγουρα μοναδική, ακόμη και σε ένα μεγάλο ευκαρυωτικό γονιδίωμα. Αντίθετα, ένα ένζυμο περιορισμού που αναγνωρίζει μερικά νουκλεοτίδια θα κόψει το γονιδίωμα, κατά μέσο όρο, κάθε μερικές χιλιάδες βάσεις. Τα ένζυμα Cas9 μπορούν να κατασκευαστούν για να φέρουν gRNA με καθορισμένες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων, προγραμματίζοντας έτσι την αλληλουχία αναγνώρισης για τη νουκλεάση. Το gRNA κατευθύνει το Cas9 να υβριδοποιηθεί με μια μοναδική, επιθυμητή θέση σε ένα γονιδίωμα, καθιστώντας το τον πιο ακριβή μηχανισμό που είναι διαθέσιμος για στόχευση και κοπή DNA.
Στους ευκαρυώτες, οι οποίοι δεν διαθέτουν σύστημα CRISPR/Cas, η διαδικασία επεξεργασίας ξεκινάει εισάγοντας τα δύο συστατικά της ώριμης ενδονουκλεάσης Cas9, το αποένζυμο και το gRNA, στα κύτταρα-ξενιστές. Αυτά τα μόρια μπορούν να προστεθούν απευθείας, ή μπορούν να προστεθούν ως κλωνοποιημένο DNA που ρυθμίζεται από έναν επαγόμενο προαγωγέα. Στην τελευταία περίπτωση, κατά την επαγωγή, το σύμπλεγμα Cas9-gRNA συναρμολογείται και εκτελεί τη λειτουργία κοπής του DNA.
Πώς το Cas9 αναγνωρίζει και υδρολύει μια συγκεκριμένη αλληλουχία DNA. Ένα μέρος του gRNA προεξέχει από το ένζυμο, διαθέσιμο για υβριδισμό. Με τον εντοπισμό του συμπληρώματός του, το gRNA προκαλεί μια μετατόπιση διαμόρφωσης στο τμήμα νουκλεάσης (πρωτεΐνης) του Cas9, το οποίο στη συνέχεια υδρολύει τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς και στους δύο κλώνους DNA. Στην απλούστερη περίπτωση, δημιουργείται μια σημειακή μετάλλαξη καθώς το κύτταρο ανακατεύεται για να επιδιορθώσει τη βλάβη.
Μερικά μικρόβια και όλοι οι ευκαρυώτες έχουν α μη ομόλογη σύνδεση τέλους (NHEJ) σύστημα που μπορεί να ενώσει ξανά τα δύο κομμάτια χρωμοσώματος. Επειδή όμως δεν είναι τέλεια επισκευή, τα συντηγμένα άκρα του DNA έχουν συχνά διαγραφή ή εισαγωγή μερικών ζευγών βάσεων. Η συνέπεια είναι συνήθως μια μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου στο γονίδιο που θα οδηγήσει σε μια ανενεργή πρωτεΐνη. Ένας περιορισμός αυτής της μεθόδου είναι ότι το αποτέλεσμα διαφέρει σε κάθε κελί.
Μια ακριβής Γονιδίωμα Cas9 Το edit αλλάζει τα νουκλεοτίδια σε μια προκαθορισμένη αλληλουχία (π.χ. ένα μεταλλαγμένο γονίδιο θα μπορούσε να αντικατασταθεί με το αλληλόμορφο άγριου τύπου). Σε αυτή την περίπτωση, μια αλληλουχία δότη πρέπει να κατασκευαστεί in vitro χρησιμοποιώντας τεχνικές απρόσκοπτης κλωνοποίησης. Το DNA του δότη περιλαμβάνει χρωμοσωμικές περιοχές που πλευρίζουν τη θέση δέσμευσης gRNA για να παρέχουν περιοχές ομολογίας για ανασυνδυασμό με το χρωμόσωμα. Η αλληλουχία δότη εισάγεται στο κύτταρο ταυτόχρονα με τα μόρια Cas9/gRNA.
Ομόλογος ανασυνδυασμός μεταξύ του σπασμένου χρωμοσώματος και της αλληλουχίας δότη θα επιδιορθώσει το δίκλωνο σπάσιμο και ταυτόχρονα θα ενσωματώσει το DNA που μεταφέρεται στο μόριο του δότη στο γονιδίωμα. Οι διαδικασίες επιλογής και διαλογής για την ταυτοποίηση μεταλλαγμένων δεν απαιτούνται με την επεξεργασία γονιδίου Cas9, σε αντίθεση με την παραδοσιακή κλωνοποίηση. Τα κύτταρα στα οποία έχει εισαχθεί το σύμπλοκο Cas9-gRNA μπορούν να επιβιώσουν και να αναπαραχθούν μόνο εάν τροποποιηθεί η αρχική αλληλουχία στόχος. Οι μη επισκευασμένες ρωγμές χρωμοσώματος διπλής έλικας είναι θανατηφόρες.
Αν και τα μοριακά συστατικά του Cas9 editing προέρχονταν αρχικά από το βακτήριο Streptococcus pyogenes,
Αυτή η τεχνική έχει χρησιμοποιηθεί συχνότερα σε ευκαρυωτικά συστήματα.
Υπάρχουν διάφοροι λόγοι για αυτό:
- Βακτήρια (~45%) και τα περισσότερα αρχαία (~85%) έχουν ομόλογα του συστήματος επεξεργασίας Cas9, περιπλέκοντας τη χρήση του σε αυτούς τους οργανισμούς.
- Άλλα εργαλεία για την επεξεργασία του γονιδιώματος υπάρχουν ήδη για πολλά μικρόβια.
- Τα περισσότερα βακτήρια στερούνται μονοπατιού επιδιόρθωσης NHEJ για την επιδιόρθωση της δίκλωνης θραύσης που δημιουργείται από τη νουκλεάση Cas9 και δεν μπορούν να επιβιώσουν από αυτή τη θεραπεία, αλλά η ομόλογη επισκευή μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά.
Παρά αυτές τις προκλήσεις, η επεξεργασία Cas9 έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε ορισμένους μικροοργανισμούς που είναι δύσκολο να χειριστούν γενετικά.
Εφαρμογές για νουκλεάση Cas9
Ερευνητές έχουν αναπτύξει άλλες εφαρμογές για την νουκλεάση Cas9 που εκμεταλλεύονται την ικανότητά της να δεσμεύει το χρωμοσωμικό DNA σε μια ενιαία γονιδιωματική θέση. Μια τροποποιημένη έκδοση του Cas9, που ονομάζεται νεκρός Cas9 (dCas9), διατηρεί τη λειτουργία εντοπισμού DNA που εκχωρείται από το gRNA, αλλά δεν κόβει πλέον το DNA. Αντίθετα, ένα μόριο dCas9-gRNA συνδεδεμένο με το DNA μπορεί να χρησιμεύσει ως πλατφόρμα για άλλα ένζυμα. Στο απλούστερο παράδειγμα, το dCas9-gRNA που είναι συνδεδεμένο με έναν προαγωγέα δρα ως καταστολέας για την αναστολή της έκφρασης των γονιδίων-στόχων.
Αντίθετα, για να ενεργοποιηθεί η μεταγραφή, το dCas9-gRNA έχει συντηχθεί με την ω υπομονάδα της RNA πολυμεράσης, ώστε να μπορεί να συνδεθεί με τον προαγωγέα ενός γονιδίου στόχου και να στρατολογήσει την RNA πολυμεράση. Η επεξεργασία του γονιδιώματος έχει αποδειχθεί χρησιμοποιώντας dCas9-gRNA συντηγμένο με πρόσθετα ένζυμα τροποποίησης του DNA.
Επειδή χρησιμοποιείται η παραλλαγή dCas9, δεν υπάρχει δραστηριότητα νουκλεάσης για να σπάσει τη ραχοκοκαλιά φωσφορικού-σακχάρου, αλλά τα άλλα ένζυμα τροποποιούν άμεσα τη βάση, για παράδειγμα, από C σε T. Το αποτέλεσμα είναι μια ακριβής αλλαγή στην αλληλουχία DNA. Πειράματα σαν αυτά έχουν δείξει την ευελιξία της μονάδας dCas9-gRNA ως συσκευή υποδοχής για να κατευθύνει μια σειρά μορίων τελεστών σε μια συγκεκριμένη χρωμοσωμική θέση.
Cas9 γονιδιακή επεξεργασία είναι μια σχετικά νέα τεχνική που υπόσχεται πολλά και οι επιστήμονες διερευνούν ενεργά τροποποιήσεις και βελτιώσεις. Έχουν προταθεί έργα τόσο ποικίλα όπως η αφαίρεση αλλεργιογόνων από τα φιστίκια μέχρι τη θεραπεία γενετικών ασθενειών στον άνθρωπο ως παραδείγματα για το τι μπορεί να είναι εφικτό. Είναι σημαντικό ότι η τεχνολογία Cas9 ανοίγει την προοπτική της μηχανικής του ανθρώπινου γονιδιώματος σε κύτταρα γεννητικής σειράς (π.χ. κύτταρα ωαρίων ή σπερματοκύτταρα), προσκαλώντας έτσι συζητήσεις σε πολλά μέτωπα για την αντιμετώπιση ηθικών ανησυχιών.
Αναφορά και Πηγές
- https://pharmaceuticalintelligence.com/tag/mirna/
- https://www.researchgate.net/publication/264433647_Structural_basis_of_PAMdependent_target_DNA_recognition_by_the_Cas9_endonuclease
- https://www.oatext.com/crispr-cas9-system-a-revolution-in-gene-editing.php
- https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2016.01740/full
- https://www.researchgate.net/publication/11577650_Recombination_at_doublestrand_breaks_and_DNA_ends_conserved_mechanisms_from_phage_to_humans
- https://www.jyi.org/2018-november/2018/11/1/the-biology-of-native-and-adapted-crispr-cas-systems
- https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167779917303049
- http://badgerapbiology.weebly.com/uploads/1/2/7/2/12727137/restriction_enzyme_lab.pdf
- https://www.researchgate.net/publication/348628647_CRISPRCas9_System_a_Revolutionary_Tool_in_the_Fight_Against_Antimicrobial_Resistance
