Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR)

Τι είναι η RT-PCR;

Η πιο ευαίσθητη τεχνική που είναι διαθέσιμη για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του αγγελιοφόρου RNA (mRNA, ή μεταγραφή) είναι η RT-PCR, που ονομάζεται επίσης Αντίστροφη μεταγραφή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης και RNA PCR. Η τεχνική είναι τόσο ευαίσθητη που είναι δυνατή η αξιολόγηση της μεταγραφής από ένα μόνο κελί.

Η μέθοδος χρησιμοποιεί ένα ένζυμο που ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφάση (το κατάλληλο όνομα είναι πολυμεράση DNA εξαρτώμενη από RNA) για τη σύνθεση ενός συμπληρωματικού κλώνου DNA (συμπληρωματικό DNA ή cDNA) από ένα πρότυπο RNA. Το cDNA που προκύπτει χρησιμοποιείται στη συνέχεια ως εκμαγείο σε μια δοκιμασία PCR χρησιμοποιώντας πολυμεράση DNA. Τα περισσότερα εργαστήρια κλινικής μικροβιολογίας χρησιμοποιούν αναλύσεις RT-PCR για την ανίχνευση ιών RNA από κλινικά δείγματα.

Το υψηλής ποιότητας πρότυπο RNA είναι σημαντικό για την RT-PCR. Στην εμπορική αγορά διατίθενται πολυάριθμα κιτ για την εξαγωγή RNA από κλινικά δείγματα, συμπεριλαμβανομένων ειδικών κιτ για ιούς και άλλους μικροοργανισμούς. Συνήθως, τα κλινικά εργαστήρια απομονώνουν ολικό RNA από δείγματα, αν και το mRNA χρησιμοποιείται στην πραγματικότητα ως πρότυπο από την ανάστροφη μεταγραφάση.

Τα κιτ είναι διαθέσιμα μόνο για εξαγωγή mRNA. Ωστόσο, το mRNA αποτελεί μόνο περίπου το 1% έως το 4% του συνολικού RNA ενός κυττάρου, επομένως είναι γενικά ευκολότερο να απομονωθεί το συνολικό RNA και να χρησιμοποιηθεί για RT-PCR. Αυτοματοποιημένα συστήματα εκχύλισης νουκλεϊκών οξέων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την απομόνωση RNA. Η ακεραιότητα του προτύπου RNA μπορεί να εκτιμηθεί με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης, Φασματοφωτομετρία UVή τη χρήση κατάλληλων μαρτύρων κατά τη διάρκεια της ανάλυσης RT-PCR.

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής

Γενικά, το RNA που εξάγεται με τη χρήση εμπορικών κιτ είναι υψηλής ποιότητας, επομένως τα περισσότερα κλινικά εργαστήρια χρησιμοποιούν ελέγχους για να αξιολογήσουν την ποιότητα και την ακεραιότητα των δειγμάτων RNA. Το γονιδιωματικό DNA σε ένα δείγμα μπορεί να μολύνει το πρότυπο RNA, επομένως τα εργαστήρια θα πρέπει να επεξεργάζονται το RNA με μια DNase – ένα ένζυμο που υδρολύει DNA—πριν χρησιμοποιηθεί το RNA σε RT-PCR. Πολλά κιτ εξαγωγής RNA περιλαμβάνουν ένα βήμα DNase.

Οι εσωτερικοί έλεγχοι χρησιμοποιούνται συνήθως κατά τη διάρκεια της RT-PCR. Όταν κλινικά εργαστήρια αναλύουν για RNA ιούς από ανθρώπινα κλινικά δείγματα, ένας εσωτερικός έλεγχος για ένα είδος ανθρώπινου RNA χρησιμοποιείται γενικά για την αξιολόγηση της ακεραιότητας και της ποιότητας ενός δείγματος.

Οι εσωτερικοί έλεγχοι για αυτές τις δοκιμασίες περιλαμβάνουν μεταγραφές από ανθρώπινα γονίδια όπως β-ακτίνη, αφυδρογονάση φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH), 18S rRNA και άλλα. Κάθε κλινικό δείγμα πρέπει να είναι θετικό κατά τη διάρκεια μιας ανάλυσης RT-PCR για έναν από αυτούς τους εσωτερικούς ελέγχους, διαφορετικά η ανάλυση δεν είναι έγκυρη.

Τα προϊόντα PCR που προκύπτουν από αναλύσεις RT-PCR μπορούν να αναλυθούν κλινικά μικροβιολογία εργαστήρια με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης ή με PCR σε πραγματικό χρόνο. Όσον αφορά την τυπική PCR, τα περισσότερα εργαστήρια χρησιμοποιούν πλέον PCR σε πραγματικό χρόνο για να αναλύσουν τα αμπλικόνια RT-PCR.

Ορισμένα κιτ που διατίθενται στο εμπόριο περιλαμβάνουν όλα τα συστατικά που χρησιμοποιούνται για δοκιμές RT-PCR και τα περισσότερα από αυτά είναι σχεδιασμένα για PCR πραγματικού χρόνου ή είναι εύκολα επιδεκτικά σε PCR πραγματικού χρόνου. Επιπλέον, ορισμένα κιτ και ASR είναι διαθέσιμα για την ανίχνευση συγκεκριμένων οργανισμών με RT-PCR.

Δύο γενικοί τύποι αναλύσεων RT-PCR χρησιμοποιούνται από κλινικά και ερευνητικά εργαστήρια:

RT-PCR ενός βήματος: Η RT-PCR ενός σταδίου χρησιμοποιεί έναν μόνο σωλήνα για τη διεξαγωγή του βήματος της αντίστροφης μεταγραφάσης και τον επακόλουθο κύκλο PCR του cDNA

Δύο βήματα RT-PCR: Η RT-PCR ενός σταδίου χρησιμοποιεί έναν μόνο σωλήνα για τη διεξαγωγή του βήματος της αντίστροφης μεταγραφάσης και τον επακόλουθο κύκλο PCR του cDNA.

Πλεονεκτήματα της χρήσης RT-PCR ενός βήματος

Ένα από τα βασικά πλεονεκτήματα της χρήσης RT-PCR ενός βήματος είναι ότι ελαχιστοποιεί την πιθανή μεταφορά αμπλικονίων στο εργασιακό περιβάλλον, τον εξοπλισμό και άλλα αντιδραστήρια ανάλυσης.
Η διακύμανση από σωλήνα σε σωλήνα μειώνεται επειδή δεν προκαλούνται πιθανά σφάλματα με την αφαίρεση του αμπλικόνιου από τον πρώτο σωλήνα και τη μεταφορά με πιπέτα σε άλλους σωλήνες.

Πλεονέκτημα της RT-PCR δύο σταδίων

Ένα πλεονέκτημα της RT-PCR δύο σταδίων είναι ότι το cDNA που προκύπτει μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε πολλούς διαφορετικούς τύπους επακόλουθων αντιδράσεων, ειδικά εάν ένα εργαστήριο επιχειρήσει να βελτιστοποιήσει μια αντίδραση.
Η RT-PCR δύο σταδίων είναι επίσης χρήσιμη για την ανίχνευση περισσότερων του ενός τύπων μεταγραφής από ένα δείγμα.
Για παράδειγμα, το εκμαγείο cDNA θα μπορούσε να αφαιρεθεί από τον πρώτο σωλήνα και να προστεθεί σε έναν δεύτερο σωλήνα, με εκκινητές ειδικούς για έναν τύπο μεταγραφής.
Ταυτόχρονα, το ίδιο πρότυπο cDNA θα μπορούσε να προστεθεί σε διαφορετικό δεύτερο σωλήνα, με άλλους εκκινητές ειδικούς για διαφορετικό αντίγραφο.
Η χρήση RT-PCR δύο σταδίων απαιτεί προσεκτική εισαγωγή με πιπέτα. Τα κλινικά εργαστήρια θα πρέπει να χρησιμοποιούν απορροφητήρα ροής για να μειώσουν
ο κίνδυνος μεταφοράς κατά το άνοιγμα του πρώτου σωλήνα cDNA.

Βήματα RT-PCR

Το αρχικό στάδιο της RT-PCR συνεπάγεται τη σύνθεση ενός cDNA συμπληρωματικού του μεταγράφου RNA με αντίστροφη μεταγραφάση. Δεν πρόκειται για συγκεκριμένη αντίδραση. Το cDNA συντίθεται από όλα τα μεταγραφήματα σε ένα σωλήνα.
Είναι διαθέσιμοι διάφοροι τύποι ανάστροφης μεταγραφάσης, συμπεριλαμβανομένης της ανάστροφης μεταγραφάσης του ιού της μυελοβλάστωσης των πτηνών (AMV), της αντίστροφης μεταγραφάσης του ιού της λευχαιμίας ποντικού Moloney και της αντίστροφης μεταγραφάσης rTth από Thermus thermophilus, μεταξύ άλλων.
Πολλές εμπορικές ανάστροφες μεταγραφάσες είναι αναμεμειγμένα ένζυμα που έχουν διαφορετικές ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένων ενζύμων που έχουν χαρακτηριστικά ανάστροφης μεταγραφάσης και DNA πολυμεράσης.
Έτσι, το ίδιο ένζυμο μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε RT-PCR ενός σωλήνα. Πολλές αντίστροφες μεταγραφάσες λειτουργούν καλύτερα στους 42°C, επομένως το πρώτο βήμα πολλών αναλύσεων RT-PCR είναι η επώαση στους 42°C για 30 λεπτά.
Μετά από αυτό το βήμα, η θερμοκρασία αυξάνεται στους 95° C για 1 έως 5 λεπτά για να μετουσιωθεί το DNA και, για αρκετά ένζυμα του εμπορίου, να απενεργοποιηθεί η λειτουργία της αντίστροφης μεταγραφάσης του ενζύμου.
Η αύξηση της θερμοκρασίας ενεργοποιεί επίσης τη λειτουργία της DNA πολυμεράσης των αναμεμειγμένων ενζύμων.
Στη συνέχεια πραγματοποιείται τυπικός κύκλος PCR και τα προϊόντα PCR αναλύονται.

Χρήσεις RT-PCR

Η RT-PCR χρησιμοποιείται συχνά σε εργαστήρια κλινικής μικροβιολογίας για την ανίχνευση ιών RNA από κλινικά δείγματα.
Η RT-PCR μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για να ποσοτικοποιήσει την ποσότητα των ιών σε κλινικά δείγματα. αυτό εκτελείται για HIV και τον ιό της ηπατίτιδας C με το σύστημα Roche Amplicor.
Άλλες εφαρμογές της RT-PCR περιλαμβάνουν την ποσοτική ανάλυση του γονιδιακή έκφρασηανίχνευση ανθρώπινων γονιδίων που εμπλέκονται σε ασθένειες και ανίχνευση καρκίνων από ανθρώπινα δείγματα.

Αναφορά και Πηγές

https://cmr.asm.org/content/20/1/49
https://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcriptase
https://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction
https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/reverse-transcription-polymerasechain-reaction
https://www.promega.in/resources/guides/nucleic-acid-analysis/pcr-amplification/
https://www.researchgate.net/publication/327283205_Control_Selection_for_RNA_Quantitation