Στο παρελθόν πολλά ιός Τα γονιδιώματα έχουν προσδιοριστεί αλληλουχία, αλλά το βακτηριακό γονιδίωμα δεν είναι δυνατό να είναι αλληλουχία. Πριν το 1995, αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος δεν ήταν δυνατή λόγω της μη διαθέσιμης υπολογιστικής ισχύος για τη συναρμολόγηση ενός γονιδιώματος από χιλιάδες DNA θραύσματα.
Αρχικά, η ομάδα των J. Craig Venter, Hamilton Smith ανέλυσε την αλληλουχία των γονιδιωμάτων δύο ελεύθερων ζωντανών βακτήρια, Mycoplasma genitalium και Haemophilus influenzae. Το γονιδίωμα του H. influenzae ήταν το πρώτο που αναλύθηκε η αλληλουχία που περιέχει περίπου 1.743 γονίδια σε 1.830.137 ζεύγη βάσεων και είναι πολύ μεγαλύτερο από ένα γονιδίωμα ιού.
Ο Venter και ο Smith ανέπτυξαν μια προσέγγιση που ονομάζεται αλληλουχία κυνηγετικών όπλων ολόκληρου του γονιδιώματος. Η διαδικασία είναι αρκετά περίπλοκη όταν εξετάζεται λεπτομερώς και υπάρχουν πολλές διαδικασίες για την εξασφάλιση της ακρίβειας των αποτελεσμάτων, αλλά η ακόλουθη περίληψη δίνει μια γενική ιδέα της προσέγγισης που χρησιμοποιήθηκε αρχικά από το Ινστιτούτο Γονιδιωματικής Έρευνας (TIGR).
Για λόγους απλότητας, αυτή η προσέγγιση χωρίζεται σε τέσσερα στάδια:
- Κατασκευή βιβλιοθήκης
- τυχαία αλληλουχία
- Ευθυγράμμιση θραυσμάτων και κλείσιμο κενού
- Επεξεργασία
Κατασκευή βιβλιοθήκης
Το μεγάλο βακτηρίδιο χρωμοσώματα τεμαχίστηκαν τυχαία σε αρκετά μικρά θραύσματα, περίπου στο μέγεθος ενός γονιδίου ή λιγότερο, χρησιμοποιώντας υπερηχητικά κύματα. τα θραύσματα στη συνέχεια καθαρίστηκαν. Αυτά τα θραύσματα προσαρτήθηκαν στο πλασμίδιο φορείςκαι απομονώθηκαν πλασμίδια με ένα μόνο ένθετο. Ειδικά στελέχη E. coli χωρίς περιοριστικά ένζυμα μετασχηματίστηκαν με τα πλασμίδια για να παραχθεί μια βιβλιοθήκη του πλασμίδιο κλώνοι.
Τυχαία αλληλουχία
Αφού παρασκευάστηκαν οι κλώνοι και το DNA καθαρίστηκε, χιλιάδες θραύσματα βακτηριακού DNA αλληλουχήθηκαν με αυτοματοποιημένους προσδιοριστές αλληλουχίας, χρησιμοποιώντας ειδικούς επισημασμένους με βαφή εκκινητές. Χιλιάδες μήτρες χρησιμοποιήθηκαν, συνήθως με γενικούς εκκινητές που αναγνώρισαν τις αλληλουχίες DNA του πλασμιδίου ακριβώς δίπλα στο ένθετο βακτηριακού DNA. Η φύση της διαδικασίας είναι τέτοια που σχεδόν όλα τα τμήματα του γονιδιώματος αλληλουχούνται πολλές φορές, και αυτό αυξάνει την ακρίβεια των τελικών αποτελεσμάτων.
Ευθυγράμμιση θραυσμάτων και κλείσιμο κενού
Με τη χρήση εξειδικευμένων προγραμμάτων υπολογιστή, τα θραύσματα DNA με αλληλουχία συγκεντρώθηκαν και συναρμολογήθηκαν σε μεγαλύτερα τμήματα αλληλουχίας συγκρίνοντας την αλληλουχία νουκλεοτιδίων μεταξύ των θραυσμάτων. Δύο θραύσματα ενώθηκαν μεταξύ τους για να σχηματίσουν ένα μεγαλύτερο τμήμα DNA εάν τα άκρα των αλληλουχιών επικαλύπτονταν και ταίριαζαν (δηλ. ήταν τα ίδια). Αυτή η διαδικασία σύγκρισης επικάλυψης οδήγησε σε ένα σύνολο μεγαλύτερων συνεχόμενων αλληλουχιών νουκλεοτιδίων ή σημείων.
Τέλος, τα contigs ευθυγραμμίστηκαν με τη σωστή σειρά για να σχηματίσουν την ολοκληρωμένη αλληλουχία γονιδιώματος. Εάν υπήρχαν κενά μεταξύ δύο σημείων, μερικές φορές ήταν διαθέσιμα δείγματα θραυσμάτων με τα άκρα τους στα δύο γειτονικά σημεία. Αυτά τα θραύσματα μπορούσαν να αναλυθούν και τα κενά να συμπληρωθούν με τις αλληλουχίες τους. Όταν αυτή η προσέγγιση δεν ήταν δυνατή, χρησιμοποιήθηκαν διάφορες άλλες τεχνικές για την ευθυγράμμιση των contigs και την κάλυψη κενών.
Για παράδειγμα, Φάγος κατασκευάστηκαν βιβλιοθήκες που περιείχαν μεγάλα θραύσματα βακτηριακού DNA. Τα μεγάλα θραύσματα σε αυτές τις βιβλιοθήκες επικαλύπτουν τις προηγούμενες αλληλουχίες contigs. Αυτά τα θραύσματα στη συνέχεια συνδυάστηκαν με ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές που ταίριαζαν με τα άκρα των προς ευθυγράμμιση σημείων. Εάν οι ανιχνευτές δεσμευθούν σε ένα θραύσμα βιβλιοθήκης, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή ενός τμήματος DNA που αντιπροσώπευε την περιοχή του διακένου. Επικάλυψη της αλληλουχίας νέο θραύσμα με δύο αγκυλώσεις θα τοποθετηθεί δίπλα-δίπλα και θα γεμίσει το κενό μεταξύ τους.
Επεξεργασία
Η αποδεικτική ανάγνωση της ακολουθίας γίνεται προσεκτικά για να επιλυθούν τυχόν ασάφειες στην ακολουθία. Επίσης η αλληλουχία ελέγχθηκε για ανεπιθύμητες μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου και διορθώθηκε εάν ήταν απαραίτητο.
Κάποιο επίτευγμα αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος
- Η προσέγγιση λειτούργησε τόσο καλά που χρειάστηκαν λιγότεροι από 4 μήνες για να προσδιοριστεί η αλληλουχία του γονιδιώματος του M. genitalium (μέγεθος περίπου 500.000 ζευγών βάσεων). Η τεχνική του κυνηγετικού όπλου έχει επίσης χρησιμοποιηθεί με επιτυχία από την Celera Genomics στο Human Genome Project και για την αλληλουχία του γονιδιώματος της Drosophila.
- Η διαδικασία του σχολιασμού θα ξεκινήσει μόλις καθοριστεί η αλληλουχία του γονιδιώματος. Ο στόχος του σχολιασμού είναι να προσδιοριστεί η θέση συγκεκριμένων γονιδίων στον χάρτη του γονιδιώματος.
- Κάθε ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF)—μια ακολουθία πλαισίου ανάγνωσης που δεν διακόπτεται από κωδικόνιο λήξης—μεγαλύτερα από 100 κωδικόνια θεωρείται ότι είναι μια πιθανή κωδικοποιητική αλληλουχία πρωτεΐνης.
- Για σύγκριση της αλληλουχίας του προβλεπόμενου ORF έναντι μεγάλων βάσεων δεδομένων που περιέχουν αλληλουχίες νουκλεοτιδίων και αμινοξέων γνωστών ενζύμων και άλλων πρωτεϊνών. Εάν μια βακτηριακή αλληλουχία ταιριάζει με μία στη βάση δεδομένων, θεωρείται ότι κωδικοποιεί την ίδια πρωτεΐνη.
- Αν και αυτή η διαδικασία σύγκρισης δεν είναι χωρίς σφάλματα, μπορεί να παρέχει δοκιμαστικές εκχωρήσεις συναρτήσεων για περίπου το 40 έως 50% των υποτιθέμενων περιοχών κωδικοποίησης.
- Παρέχει επίσης ορισμένες πληροφορίες σχετικά με τα μετατιθέμενα στοιχεία, οπερόνιαεπαναλάβετε τις αλληλουχίες, την παρουσία διαφόρων μεταβολικών οδών και άλλα χαρακτηριστικά γονιδιώματος.
Αναφορά και πηγές
- https://www.biotecharticles.com/Bioinformatics-Article/Genome-Sequencing-Strategies-3221.html
- https://studydriver.com/recent-advances-in-dna-sequencing-technologies/
- https://journals.plos.org/ploscompbiol/article?id=10.1371/journal.pcbi.0010024
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC113951/
- https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780444636683000019
- https://en.wikipedia.org/wiki/Shotgun_sequencing
